文庫制備過程中最重要的 QC 步驟之一發(fā)生在 NGS 工作流程開始之前。這一關(guān)鍵 QC 步驟就是分析要使用的起始材料，無論是 DNA 還是 RNA。確保高質(zhì)量的起始材料是制備高質(zhì)量文庫并獲得成功測序結(jié)果的第一步。大多數(shù) NGS 文庫制備試劑盒建議使用特定的起始濃度和起始量，以獲得最佳測序結(jié)果。如果起始材料降解或質(zhì)量較差，可能會難以甚至無法利用樣品制備文庫。本文將綜述常見的 NGS 起始材料基因組 DNA（gDNA）的質(zhì)控。
gDNA 材料的儲存條件可能會影響其完整性。為了了解儲存溫度對 gDNA 的影響，Permenter 等[1] 比較了室溫和 4 °C 下，在不同類型的保存管中儲存 1–130 天的 gDNA樣品的質(zhì)量。為了分析降解情況，他們通過使用 TapeStation系統(tǒng)獲得的電泳圖實(shí)現(xiàn)了對樣品完整性的可視化，并在150–10000 bp 范圍內(nèi)根據(jù)曲線下面積計(jì)算了降解程度。完整的樣品顯示大部分為高分子量物質(zhì)（超過 10000 bp），表明為完整的 gDNA，而片段化或降解的樣品則會在整個指定的降解范圍內(nèi)出現(xiàn)彌散條帶（示例參見文獻(xiàn)）。在此示例中，質(zhì)量最高的樣品是在 EDTA 管中冷凍保存的樣品。DNA 指紋圖譜和 SNP 分析等下游分析均表明 gDNA 的質(zhì)量關(guān)系著數(shù)據(jù)的質(zhì)量。這為正確處理 gDNA 提供了有價值的信息，并表明了高質(zhì)量起始材料對于 NGS 等高靈敏度應(yīng)用的重要性。
在開發(fā)新方法時，了解各種程度的條件變化如何影響樣品十分重要。例如，在 Zhong 等[2] 的研究中，用不同的方法和試劑對免疫沉淀 DNA 進(jìn)行純化，然后考察了所得 DNA 用于 ChIP測序文庫和測序時的質(zhì)量。使用片段分析儀系統(tǒng)測定了不同純化方法得到的 DNA 樣品的分子量（圖 1）。結(jié)果表明，使用 SPRI 磁珠類試劑進(jìn)行純化可消除 100 bp 以下的片段，而純化柱提取和苯酚氯仿 (PC) 方法則會回收 35 bp 以下的片段。由于ChIP 測序工作流程傳統(tǒng)上會進(jìn)行片段化并選擇 100–300 bp 的DNA 進(jìn)行測序，因此基于純化柱和 SPRI 磁珠的純化方法不會影響其測序覆蓋率。但是，作者指出，對于需要 100 bp 以下片段的應(yīng)用，在計(jì)劃實(shí)驗(yàn)時應(yīng)考慮樣品純化方法和所得樣品分子量。
成功的文庫制備和測序結(jié)果需要高質(zhì)量核酸。為了幫助鑒定合格質(zhì)量的樣品，安捷倫開發(fā)了多種質(zhì)量評分，專門針對不同的自動化電泳平臺。這些質(zhì)量指標(biāo)為用戶提供了可靠的樣品完整性評估，減少人為錯誤和用戶評估之間的差異，節(jié)省了時間和成本，同時可輕松識別會導(dǎo)致不良結(jié)果的不合格樣品。例如，片段分析儀和 Femto Pulse 系統(tǒng)可以利用基因組質(zhì)量值(GQN) 評估經(jīng)過打斷的 gDNA。對于這一評分，用戶可以根據(jù)具體應(yīng)用設(shè)定閾值并應(yīng)用于樣品。然后，根據(jù)測得的高于指定分子量閾值樣品的總濃度分?jǐn)?shù)計(jì)算 GQN 值。GQN 按 0 到 10 的等級對樣品進(jìn)行評分，0 表示樣品均未超過分子量閾值。10 表示樣品 100% 高于分子量閾值。此外，TapeStation 系統(tǒng)可提供有關(guān) gDNA 質(zhì)量的 DNA 完整值 (DIN)，這是一個不受用戶影響的客觀評分。DIN 按 1 到 10 對樣品進(jìn)行評分。高 DIN 代表高度完整的 gDNA，而低 DIN 則代表高度降解的 gDNA 樣品。對福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織的處理尤為困難，因?yàn)闉榱碎L期保存，通常采用化學(xué)方法固定?？梢詮拇祟惤M織中提取核酸，但由于保存技術(shù)導(dǎo)致的交聯(lián)和降解，其質(zhì)量通常低于新鮮組織。低質(zhì)量的核酸導(dǎo)致 FFPE 樣品難以用于 NGS 等高靈敏度的下游分析。但是，通過確定樣品的質(zhì)量，并對如何優(yōu)化文庫制備方案做出明智決策，可以實(shí)現(xiàn)對 FFPE 樣品的成功測序。例如，Muscarella 等[3] 評估了通過不同提取方法獲得的 FFPE gDNA 的 TapeStation DIN 值，以幫助確定用于腫瘤學(xué)研究的可靠 NGS 工作流程。作者指出：“ DIN 值使電泳圖解析更容易，有利于樣品間的比較，并為 NGS 技術(shù)提供了出色的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性和高質(zhì)量基因組 DNA 的定量?！?nbsp;[3] 所有使用手動或自動試劑盒提取的樣品均顯示 DIN > 4.4，試劑盒之間的質(zhì)量沒有顯著差異。苯酚-氯仿提取的樣品質(zhì)量明顯偏低，其中一個樣品的 DIN 值為 1.9，還有兩個樣品嚴(yán)重降解，無法計(jì)算 DIN 值。每種試劑盒的代表性示例以及每種方法的平均 DIN 值如圖 2 所示。每種提取方法得到的樣品均用于 NGS 文庫制備，并使用 TapeStation 系統(tǒng)對所得文庫的質(zhì)量進(jìn)行評估。每個文庫表現(xiàn)出相似的擴(kuò)增模式，濃度分布均勻。盡管所有樣品均提供了良好的測序結(jié)果，但作者指出，采用自動化方法提取 FFPE gDNA 可以節(jié)省時間和昂貴的試劑，且質(zhì)量優(yōu)于手動方法，并獲得了更高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。
安捷倫自動化電泳儀提供了一系列試劑盒，可兼容多種樣品類型和分子量，可提供準(zhǔn)確可靠的分子量測定、定量和摩爾濃度。此外，每種儀器均采用專為平臺優(yōu)化的特定質(zhì)量指標(biāo)，可對樣品完整性進(jìn)行客觀評估。盡管不同類型的儀器質(zhì)量指標(biāo)的計(jì)算有所不同，但最終的質(zhì)量評分在不同平臺間具有很高的可比性。多篇文獻(xiàn)均證明自動化電泳儀非常適合這類重要的 QC 步驟，不僅適用于傳統(tǒng)的 NGS 文庫制備，還可用于故障排除和方案優(yōu)化，以及為復(fù)雜或獨(dú)特樣品開發(fā)定制工作流程。
參考文獻(xiàn)：
- Permenter, J.; Ishwar, A.; Rounsavall, A.; Smith, M.; Faske, J.; Sailey, C. J.; and Alfaro, M. P. Quantitative Analysis of Genomic DNA Degradation in Whole Blood Under Various Storage Conditions for Molecular Diagnostic Testing. Mol. Cell Probes 2015, 29, 449–453
- Zhong, J.; Ye, Z.; Lenz, S. W.; Clark, C. R.; Bharucha, A.; Farrugia, G.; Robertson, K. D.; Zhang, Z.; Ordog, T.; and Lee, J. H. Purification of Nanogram-Range Immunoprecipitated DNA in ChIP-seq Application.BMC Genomics 2017, 18, 985.